Образцы мозга
В этом исследовании использовались полушария пяти человек (включая половину головного мозга, мозжечка и ствола мозга) после информированного согласия на использование ткани для исследования и этического одобрения исследования Национальным комитетом службы этики исследований Лондон – Центральный. Все полушария фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (рис. 1а). Латеральность и демографические данные обобщены в дополнительной таблице 1; доноры были неврологически нормальными, но в одном случае была недиагностированная бессимптомная опухоль (диаметром примерно 10 мм) в белом веществе, прилегающем к покрышке. Эта опухоль не вызывала проблем ни на одном из этапов обработки, описанных ниже.
Сбор данных
МРТ-сканирование
Перед препарированием полушария сканировали на сканере 3-T Siemens MAGNETOM Prisma. Образцы были помещены в контейнер, наполненный Fluorinert (перфторуглеродом), жидкостью, не содержащей протонов и не имеющей сигнала МРТ, которая обеспечивает превосходный контраст МРТ ex vivo и не влияет на последующий гистологический анализ58. МРТ-сканы были получены с использованием Т2-взвешенной последовательности (оптимизированная длинная последовательность эхо-сигналов, 3D быстрое спин-эхо59) со следующими параметрами: TR = 500 мс, TEeff = 69 мс, BW = 558 Гц на пиксель, интервал эхо-сигналов = 4,96 мс, длина последовательности эхо-сигналов = 58, 10 средних значений, с изотропным разрешением 400 мкм, время сбора данных для каждого среднего значения = 547 с, общее время сканирования = 91 мин. Эти сканы были обработаны с помощью комбинации SAMSEG35 и кортикального потока FreeSurfer 7.051 для коррекции поля смещения изображений, создания грубых подкорковых сегментаций и получения поверхностей белого вещества и мягких мозговых оболочек с соответствующими парцелляциями в соответствии с атласом Дезикана-Киллиани29 (рис. 1b).
Диссекция
После МРТ-сканирования каждое полушарие рассекается и помещается в стандартные кассеты размером 74 × 52 мм. Сначала каждое полушарие было разделено на большой мозг, мозжечок и ствол мозга. Используя металлический каркас в качестве направляющей, их впоследствии разрезали на срезы толщиной 10 мм в корональной, сагиттальной и аксиальной ориентации соответственно. Эти срезы были сфотографированы внутри прямоугольной рамки известных размеров для коррекции размера пикселей и перспективы; мы называем эти изображения «фотографии целиком». Хотя срезы ствола мозга и мозжечка помещались в кассеты, срезы головного мозга были дополнительно разрезаны на столько блоков, сколько необходимо. Для этих блоков также были сделаны «фотографии заблокированных срезов» (рис. 1в, слева).
Обработка и секционирование тканей
После стандартных этапов обработки ткани каждый блок ткани заливали в парафин и с помощью санного микротома делали срезы толщиной 25 мкм. Перед каждым разрезом делалась фотография камерой Nikon D5100 с разрешением 24 МП (ISO = 100, диафрагма = f/20, выдержка = автоматическая), установленной прямо над микротомом и направленной перпендикулярно плоскости среза. Эти фотографии (далее «фотографии с блокировкой») были скорректированы по размеру пикселя и перспективе с использованием реперных маркеров. Фотографии блоков имеют плохой контраст между серым и белым веществом (рис. 1c, справа), но также незначительные нелинейные геометрические искажения, поэтому их можно легко объединить в трехмерные объемы. Двумерная сверточная нейронная сеть (>), предварительно обученная на наборе данных ImageNet60 и точно настроенная на 50 помеченных вручную примерах, использовалась для автоматического создания бинарных масок тканей для изображений блочных лиц.
Окрашивание и оцифровка
Мы помещали их на предметные стекла и окрашивали два последовательных среза каждый раз. Н (см. ниже), один с H&E и один с LFB (рис. 1d). Интервал выборки был Н = 10 (т.е. 250 мкм) для блоков, включающих подкорковые структуры головного мозга, медиальные структуры мозжечка или структуры ствола мозга. Интервал был Н = 20 (500 мкм) для всех остальных блоков. Все окрашенные срезы были оцифрованы с помощью планшетного сканера с разрешением 6400 точек на дюйм (размер пикселя 3,97 мкм). Тканевые маски были созданы с использованием двумерной >, аналогичной той, которая используется для фотографий блочных лиц (предварительно обученной в ImageNet и точно настроенной на 100 помеченных вручную примерах).
Данные ADNI in vivo
Плотная маркировка гистологии
Сегментация 333 ROI (34 корковых, 299 подкорковых) была выполнена авторами ER, JA и EB (под руководством DK, MB, ZJ и JCA) для всех разделов LFB с использованием комбинации ручных и автоматизированных методов (рис. 1e). Общая процедура маркировки каждого блока заключалась в следующем: (1) произвести точную сегментацию для одного из каждых четырех разделов, (2) запустить SmartInterpol28 для автоматического сегментирования промежуточных разделов и (3) вручную исправить эти автоматически сегментированные разделы, когда это необходимо. SmartInterpol — это специальная технология искусственного интеллекта, которую мы разработали специально для ускорения сегментации гистологических наборов в этом проекте.
Чтобы получить точную сегментацию на разреженных участках, мы использовали две разные стратегии в зависимости от области мозга. Для блоков, содержащих подкорковые или стволовые структуры, рентабельность инвестиций отслеживалась вручную с нуля с использованием комбинации ITK-SNAP61 и программы просмотра FreeSurfer «Freeview». Для блоков мозжечка мы сначала обучили двумерную > (U-Net62) на 20 срезах, на которых вручную пометили белое вещество, а также молекулярные и зернистые слои коры. Затем > запускалась на (редких) участках и результаты корректировались вручную. Эта процедура экономит значительное количество времени, поскольку отслеживание извилистой формы древовидной жизни вручную занимает чрезвычайно много времени. Для блокад коры головного мозга мы использовали ту же стратегию, что и для мозжечка, обозначая ткань как белое или серое вещество. Разделение кортикального серого вещества на участки было достигнуто путем взятия ближайшей соседней кортикальной метки с выровненного МРТ-скана (подробности о выравнивании приведены ниже).
Маркировка вручную проводилась в соответствии с нейроанатомическими протоколами, основанными на различных атласах головного мозга, в зависимости от области мозга. Более подробная информация о конкретных протоколах разграничения представлена в дополнительной информации. Общая онтология 333 ROI основана на эталонном мозге Аллена3 и представлена в виде электронной таблицы как часть дополнительной информации.
3D гистологическая реконструкция
3D-гистологическая реконструкция — это обратная задача устранения всех искажений, которым подвергается ткань головного мозга во время сбора данных, для воссоздания 3D-формы, которая точно соответствует исходной анатомии. Для этой цели мы использовали фреймворк с четырьмя модулями.
Первоначальное выравнивание грани блока
Улучшенное согласование с предварительной нелинейной моделью.
Как только будет достигнуто хорошее первоначальное выравнивание, мы сможем использовать разделы LFB для уточнения регистрации. Эти изображения LFB обладают превосходным контрастом (рис. 1d), но страдают от нелинейных искажений, поэтому правильная инициализация изображений блочных граней имеет решающее значение. Процедура регистрации была практически идентична процедуре регистрации Blockface, с двумя основными отличиями. Во-первых, термин сходства использовал локальную (а не глобальную) нормализованную функцию взаимной корреляции64 для устранения неравномерного окрашивания срезов. Во-вторых, модель деформации и иерархия оптимизации немного отличались, поскольку нелинейная регистрация выигрывает от более надежных методов. В частности, первые два уровня оптимизации были одинаковыми: блоки были сгруппированы в головной мозг/мозжечок/ствол мозга (первый уровень) или срезы мозга (второй уровень) и оптимизация преобразований сходства. Третий уровень (то есть каждый блок независимо) был разделен на четыре этапа, на которых мы оптимизировали преобразования с возрастающей сложностью, так что решение каждого уровня сложности служило инициализацией следующего. На первом и самом простом этапе мы разрешили перемещение во всех направлениях, вращение в плоскости и глобальное масштабирование (пять параметров на блок). На втором этапе мы добавили другой параметр масштабирования в нормальном направлении блока (шесть параметров на блок). На третьем этапе мы разрешили вращение во всех направлениях (восемь параметров на блок). На четвертом и последнем этапе мы добавили в каждую секцию каждого блока нелинейное поле, смоделированное сеткой контрольных точек (интервал 10 мм) и интерполирующими B-сплайнами. Эта окончательная модель деформации имеет около 100 000 параметров на случай (около 100 параметров на секцию, умноженную на около 1000 сечений LFB).
Нелинейная регистрация искусственного интеллекта
Байесовское уточнение
Независимое выполнение SbR для каждого пятна и среза (т. е. LFB для МРТ с повторной выборкой и H&E для МРТ с повторной выборкой) дает неровную реконструкцию, чувствительную к складкам и разрывам. Одной из альтернатив является регистрация каждого гистологического среза непосредственно с каждым соседом, что обеспечивает плавную реконструкцию, но вызывает так называемый «эффект банана»: то есть выпрямление изогнутых структур14. Мы предложили байесовский метод, который дает плавные реконструкции без эффекта банана25. Этот метод следует чрезмерно ограниченной стратегии путем вычисления регистраций между LFB и MRI, H&E и MRI, H&E и LFB, каждой секцией LFB и двумя ближайшими соседями в любом направлении по стеку, каждой секцией H&E и ее соседями, а также каждым срезом MRI и его соседями. Для стека с Сразделов, эта процедура дает 15хS-18регистраций, тогда как базовая размерность связующего дерева, соединяющего все изображения, составляет всего 3x.С -1. Мы используем вероятностную модель SVF, чтобы вывести наиболее вероятное связующее дерево с учетом вычисленных регистраций, которые рассматриваются как зашумленные измерения комбинаций преобразований в связующем дереве. Вероятностная модель использует распределение Лапласа, которое опирается на нормы L1 и, таким образом, устойчиво к выбросам. Более того, свойства SVF позволяют нам записать задачу оптимизации в виде линейной программы, которую мы решаем с помощью стандартного симплексного алгоритма71. Результатом этой процедуры стала 3D-реконструкция, которая является точной (об этом свидетельствуют многочисленные регистрации), надежной и гладкой (рис. 1g и 2).
Строительство Атласа
Учитывая небольшое количество доступных случаев, мы объединили левое (2) и правое (3) полушария в единый атлас. Это было достигнуто путем переворачивания правых полушарий и расчета вероятностного атласа левого полушария с использованием итерационной техники33. Чтобы инициализировать процедуру, мы зарегистрировали сканы МРТ в атласе MNI15 с замаскированным правым полушарием и усреднили деформированные сегментации, чтобы получить первоначальную оценку вероятностного атласа. Эта первая регистрация была основана на интенсивностях с использованием локальных нормализованных потерь взаимной корреляции. С этого момента алгоритм работает исключительно с сегментами.
Каждая итерация процесса построения атласа состоит из двух этапов. Во-первых, текущая оценка атласа и сегментации регистрируются по одной с использованием (1) модели диффеоморфной деформации, основанной на SVF, параметризованной сетками контрольных точек и B-сплайнами (как реализовано в NiftyReg72), которая сохраняет топологию сегментаций; (2) термин данных, который представляет собой логарифмическую вероятность метки в каждом вокселе в соответствии с вероятностями, заданными деформированным атласом (со слабым Дирихле перед предотвращением нулевых логарифмов); и (3) регуляризатор, основанный на энергии изгиба поля, который обеспечивает регулярность деформаций. На втором этапе каждой итерации атлас обновляется путем усреднения сегментаций. Процедура сходилась (незначительные изменения в атласе) после пяти итераций. Срезы атласа показаны на рис. 1 час и 3.
Байесовская сегментация
Наш алгоритм байесовской сегментации основан на хорошо зарекомендовавших себя методах, описанных в литературе по нейровизуализации18,73,74. Короче говоря, алгоритм совместно оценивает набор параметров, которые лучше всего объясняют наблюдаемое изображение в свете вероятностного атласа, в соответствии с генеративной моделью, основанной на модели гауссовой смеси (GMM), обусловленной сегментацией, в сочетании с моделью поля смещения. Параметры включают деформацию вероятностного атласа; набор коэффициентов, описывающих поле смещения; а также средние значения, отклонения и веса GMM. Деформация атласа регуляризуется так же, как и построение атласа (в нашем случае энергия изгиба) и оценивается посредством численной оптимизации с помощью LBFGS. Поле смещения и параметры GMM оцениваются с помощью алгоритма максимизации ожидания75.
По сравнению с классическими методами байесовской сегментации, работающими с разрешением 1 мм и всего несколькими классами (например, SAMSEG35, SPM18), предлагаемый нами метод имеет несколько отличительных особенностей:
-
(1)
Поскольку атлас описывает только левое полушарие, мы используем метод быстрой регистрации глубокого обучения (EasyReg76) для регистрации входного сканирования в пространстве MNI и используем полученную деформацию для разделения мозга на два полушария, которые обрабатываются независимо.
-
(2)
Поскольку атлас моделирует только ткань мозга, мы запускаем SynthSeg77 на входном скане, чтобы замаскировать внемозговую ткань.
-
(3)
Кластеризация ROI по типам тканей (вместо того, чтобы каждая ROI имела свою собственную гауссову величину) особенно важна, учитывая большое количество ROI (333). Пользователь может указать кластеризацию с помощью файла конфигурации; по умолчанию наша общедоступная реализация использует конфигурацию с 15 типами тканей, адаптированную для сегментации МРТ in vivo.
-
(4)
Платформа реализована с использованием пакета PyTorch, который позволяет ей работать на графических процессорах и сокращает время выполнения сегментации примерно до получаса на полушарие.
Образцы сегментации с помощью этого метода можно найти на рис. 1h (in vivo) и рис. 4 (ex vivo).
Маркировка МРТ головного мозга сверхвысокого разрешения ex vivo
Чтобы количественно оценить точность нашего метода сегментации при сканировании ex vivo со сверхвысоким разрешением, мы разработали золотой стандарт сегментации общедоступного 100-мкм сканирования12 следующим образом. Во-первых, мы снизили разрешение данных до разрешения 200 мкм и исключили левое полушарие, чтобы облегчить требования к ручной маркировке. Затем мы использовали Freeview, чтобы вручную с нуля пометить один корональный срез из каждых десяти; мы пометили столько областей из гистологического протокола, сколько позволял контраст МРТ, без разделения коры головного мозга. Затем мы использовали SmartInterpol28, чтобы завершить сегментацию недостающих срезов. Затем мы вручную корректировали выходные данные SmartInterpol по мере необходимости, пока не были удовлетворены изотропной сегментацией 200 мкм. Кора головного мозга была разделена с использованием стандартных процедур FreeSurfer. Эта схема маркировки привела к истинной сегментации с 98 ROI, которые мы сделали общедоступными. Дополнительные видеоролики 3 и 4 пролетают над корональными и аксиальными срезами помеченного сканирования соответственно.
Мы использовали упрощенную версию атласа NextBrain при сегментации 100-мкм сканирования, чтобы лучше сопоставить рентабельность инвестиций в автоматическую сегментацию и основную истину (особенно в стволе мозга). Эта версия была создана путем замены меток ствола мозга в гистологической 3D-реконструкции (рис. 1g, справа) новыми сегментациями, сделанными непосредственно на лежащем в основе МРТ-сканировании. Эти сегментации были выполнены теми же методами, что и для изотропного сканирования на длине волны 100 мкм. Новые комбинированные сегментации были использованы для восстановления атласа.
Автоматизированная сегментация с помощью шаблона Allen MNI
Автоматизированная маркировка с помощью шаблона Allen MNI основывалась на сегментации на основе регистрации с помощью пакета NiftyReg34,72, который обеспечивает самые современные характеристики регистрации МРТ головного мозга78. Мы использовали ту же модель деформации и параметры, которые авторы NiftyReg использовали в своей собственной работе по сегментации на основе регистрации79: (1) симметричная регистрация с моделью деформации, параметризованной сеткой контрольных точек (интервал 2,5 мм = 5 вокселей) и интерполяцией B-сплайном; (2) локальная нормализованная взаимная корреляция как целевая функция (стандартное отклонение 2,5 мм); и (3) регуляризация энергии изгиба (вес 0,001).
LDA для классификации болезни Альцгеймера
Мы провели линейную классификацию болезни Альцгеймера по сравнению с контрольной группой на основе объемов рентабельности инвестиций следующим образом. Оставляя по одному субъекту за раз, мы использовали всех остальных субъектов для (1) расчета коэффициентов линейной регрессии для поправки на пол и возраст (внутричерепной объем корректировался путем деления); (2) оценить средние векторы для двух классов (({{mathbf{upmu }}}_{0}, {{mathbf{upmu }}}_{1})), а также объединенную ковариационную матрицу (С ); и (3) использовать средние значения и ковариацию для вычисления несмещенного критерия логарифмического подобия. л для пропущенной темы:
$$L({bf{x}})={({{mathbf{upmu }}}_{1}-{{mathbf{upmu }}}_{0})}^{t},{{Sigma }}^{-1}[{bf{x}}-0.5,({{mathbf{upmu }}}_{1}+{{mathbf{upmu }}}_{0})],$$
где х — вектор с объемами, скорректированными по ICV, полу и возрасту для неучтенного субъекта. Как только критерий л был вычислен для всех субъектов, он может быть глобально пороговым для точности и ROC-анализа. Отметим, что для NextBrain большое количество ROI делает ковариационную матрицу сингулярной. Мы предотвращаем это, используя регуляризованный LDA: мы нормализуем все ROI к единичной дисперсии, а затем вычисляем ковариацию как (Sigma =S+{rm{lambda }}I,) где С – выборочная ковариация, я — единичная матрица, а ({rm{lambda }}=1,0) — константа. Мы отмечаем, что нормализация к единичной дисперсии позволяет нам использовать фиксированную единицу λ вместо того, чтобы оценивать λ для каждого неучтенного субъекта.
Подбор B-сплайна траекторий старения
Чтобы вычислить соответствие B-сплайна на рис. 8 расширенных данных, мы сначала скорректировали объемы ROI по полу (с использованием регрессии) и внутричерепному объему (путем деления). Затем мы смоделировали данные с помощью распределения Лапласа, которое устойчиво к выбросам, которые могут быть вызваны потенциальными ошибками сегментации. В частности, мы использовали зависящий от возраста лапласиан, где местоположение м и масштабировать боба представляют собой B-сплайны с четырьмя равномерно распределенными контрольными точками через 30, 51,6, 73,3 и 95 лет. Подбор оптимизирован с помощью градиентного подъема по функции логарифмического правдоподобия:
$$L({theta }_{mu },{theta }_{b})=mathop{sum }limits_{n=1}^{N}mathrm{log},{rm{p}}[{v}_{n};mu ({a}_{n};{theta }_{mu }),b({a}_{n};{theta }_{b})],$$
где (p(x;mu,b)) — распределение Лапласа с местоположением м и масштабировать б; вн это объем ROI для предмета н; анвозраст субъекта н; (mu ({a}_{{n}};{theta }_{{mu }})) — это B-сплайн, описывающий местоположение, параметризованный ям; и (b({a}_{n};{theta }_{b})) — B-сплайн, описывающий масштаб, параметризованный яб. 95% доверительный интервал распределения Лапласа определяется выражением м± 3б.
Заявление об этике
Программа и протоколы донорства мозга получили этическое одобрение для исследований Национальным комитетом службы этики исследований Лондон-Центральный, а ткани хранятся для исследований в соответствии с лицензией, выданной Управлением по тканям человека (№ 12198).
Сводная отчетность
#Вероятностный #гистологический #атлас #головного #мозга #человека #для #сегментации #МРТ